Микроскоп (оптич. прибор)

Микроскоп (далее М) (от микро... и греч. skopéo — смотрю), оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооруженным глазом. Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определенным разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они еще могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм) минимальное разрешение составляет примерно 0,08 мм (а у многих людей — около 0,20 мм). Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены М (оптич. прибор) различных типов. С помощью М (оптич. прибор) определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. М (оптич. прибор) дает возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм.

Историческая справка. Свойство системы из двух линз давать увеличенные изображения предметов было известно уже в 16 в. в Нидерландах и Северной Италии мастерам, изготовлявшим очковые стекла. Имеются сведения, что около 1590 прибор типа М (оптич. прибор) был построен З. Янсеном (Нидерланды). Быстрое распространение М (оптич. прибор) и их совершенствование, главным образом ремесленниками-оптиками, начинается с 1609—10, когда Г. Галилей, изучая сконструированную им зрительную трубу, использовал ее и в качестве М (оптич. прибор), изменяя расстояние между объективом и окуляром. Первые блестящие успехи применения М (оптич. прибор) в научных исследованиях связаны с именами Р. Гука (около 1665; в частности, он установил, что животные и растительные ткани имеют клеточное строение) и особенно А. Левенгука, открывшего с помощью М (оптич. прибор) микроорганизмы (1673—77). В начале 18 в. М (оптич. прибор) появились в России: здесь Л. Эйлер (1762; "Диоптрика", 1770—71) разработал методы расчета оптических узлов М (оптич. прибор) В 1827 Дж. Б. Амичи впервые применил в М (оптич. прибор) иммерсионный объектив. В 1850 английский оптик Г. Сорби создал первый М (оптич. прибор) для наблюдения объектов в поляризованном свете.

Широкому развитию методов микроскопических исследований и совершенствованию различных типов М (оптич. прибор) во 2-й половине 19 и в 20 вв. в значительной степени способствовала научная деятельность Э. Аббе, который разработал (1872—73) ставшую классической теорию образования изображений несамосветящихся объектов в М (оптич. прибор) Английский ученый Дж. Сиркс в 1893 положил начало интерференционной микроскопии. В 1903 австр. исследователи Р. Зигмонди и Г. Зидентопф создали т. н. ультрамикроскоп. В 1935 Ф. Цернике предложил метод фазового контраста для наблюдения в М (оптич. прибор) прозрачных слабо рассеивающих свет объектов. Большой вклад в теорию и практику микроскопии внесли сов. ученые — Л. И. Мандельштам, Д. С. Рождественский, А. А. Лебедев, В. П. Линник.

Оптическая схема, принцип действия, увеличение и разрешающая способность микроскопа. Одна из типичных схем М (оптич. прибор) приведена на рис. 1. Рассматриваемый объект (препарат) 7 располагают на предметном стекле 10. Конденсор 6 концентрирует на объекте пучок света, отражающегося от зеркала 4. Источником света в М (оптич. прибор) чаще всего служит специальный осветитель, состоящий из лампы и линзы-коллектора (соответственно 1 и 2 на рис.); иногда зеркало направляет на объект обычный дневной свет. Диафрагмы — полевая 3 и апертурная 5 ограничивают световой пучок и уменьшают в нем долю рассеянного света, попадающего на препарат "со стороны" и не участвующего в формировании изображения.

Возникновение изображения препарата в М (оптич. прибор) в основных (хотя и наиболее простых) чертах можно описать в рамках геометрической оптики. Лучи света, исходящие от объекта 7, преломляясь в объективе 8, создают перевернутое и увеличенное действительное изображение оптическое 7` объекта. Это изображение рассматривают через окуляр 9. При визуальном наблюдении М (оптич. прибор) фокусируют так, чтобы 7" находилось непосредственно за передним фокусом окуляра _oк. В этих условиях окуляр работает как лупа: давая дополнительное увеличение, он образует мнимое изображение 7" (по-прежнему перевернутое); проходя через оптические среды глаза наблюдателя, лучи от 7" создают на сетчатке глаза действительное изображение объекта. Обычно 7" располагается на расстоянии наилучшего видения D от глаза. Если сдвинуть окуляр так, чтобы 7" оказалось перед _oк, то изображение, даваемое окуляром, становится действительным и его можно получить на экране или фотопленке; по такой схеме производят, в частности, фото- и киносъемку микроскопических объектов (см. Микропроекция).

Общее увеличение М (оптич. прибор) равно произведению линейного увеличения объектива на угловое увеличение окуляра:

(см. Увеличение оптическое). Увеличение объектива b = D/f"_oб, где D — расстояние между задним фокусом объектива "_oб и передним фокусом окуляра (т. н. оптическая длина тубуса М (оптич. прибор)), f`_oб, — фокусное расстояние объектива. Увеличение окуляра, как и лупы, выражается формулой

(f"_oк берется в мм). Обычно объективы М (оптич. прибор) имеют увеличения от 6,3 до 100, а окуляры — от 7 до 15 (их значения гравируются на оправах). Поэтому общее увеличение М (оптич. прибор) лежит в пределах от 44 до 1500.

Разумеется, технически возможно применить в М (оптич. прибор) объективы и окуляры, которые дадут общее увеличение, значительно превышающее 1500. Однако обычно это нецелесообразно. Большие увеличения не являются самоцелью — назначение М (оптич. прибор) состоит в том, чтобы обеспечить различение как можно более мелких элементов структуры препарата, т. е. в максимальном использовании разрешающей способности М (оптич. прибор) А она имеет предел, обуслопленный волновыми свойствами света. (В геометрической оптике, в рамках которой выше было рассмотрено образование изображения в М (оптич. прибор), отвлекаются от этих свойств света, но предел возможностей М (оптич. прибор) определяют именно они.) Согласно общей закономерности, наблюдая объект в каком-либо излучении с длиной волны l, невозможно различить элементы объекта, разделенные расстояниями, намного меньшими, чем l. Эта закономерность проявляется и в М (оптич. прибор), причем количественное ее выражение несколько различно для самосветящихся и несамосветящихся объектов. Изображение испускающей монохроматический свет точки, даваемое даже идеальным (не вносящим никаких искажений) объективом, не воспринимается глазом как точка, так как вследствие дифракции света фактически является круглым светлым пятнышком конечного диаметра d, окруженным несколькими попеременно темными и светлыми кольцами (т. н. дифракционное пятно, пятно Эри, диск Эри). d = 1,22 l/A, где l — длина волны света (при освещении препарата немонохроматическим светом l — обычно наименьшая длина волны, характеризующая этот свет, либо длина волны, интенсивность излучения на которой максимальна), А — числовая апертура объектива, равная А = n · sin u_m (n — показатель преломления среды, разделяющей светящуюся точку и объектив, u_m — половина угла раствора светового пучка, исходящего из точки и попадающего в объектив). Если две светящиеся точки расположены близко друг от друга, их дифракционные картины накладываются одна на другую, давая в плоскости изображения сложное распределение освещенности (рис. 2). Наименьшая относительная разница освещенностей, которая может быть замечена глазом, равна 4 %. Этому соответствует наименьшее расстояние между точками, при котором их изображения можно различить — предельное разрешение М (оптич. прибор): d_пр = 0,42d = 0,51 l/A. Для несамосветящихся объектов, как было показано Э. Аббе в его классической теории М (оптич. прибор), предельное разрешение составляет d_пр = l/(А + А"), где А и A" — числовые апертуры объектива и конденсора М (оптич. прибор) (значения апертур гравируются на оправах).

Изображение любого объекта состоит из совокупности изображений отдельных элементов его структуры. Мельчайшие из них воспринимаются как точки, и к ним полностью применимы ограничения, следующие из дифракции света в М (оптич. прибор) — при расстояниях между ними, меньших предельного разрешения М (оптич. прибор), они сливаются и не могут наблюдаться раздельно. Существенно повысить разрешающую способность М (оптич. прибор) можно, только увеличивая А. В свою очередь, увеличить А можно лишь за счет повышения показателя преломления n среды между объектом и объективом (т. к. sinu_m £ 1). Это и осуществлено в иммерсионных системах, числовые апертуры которых достигают величины А = 1,3 (у обычных "сухих" объективов макс. А " 0,9).

Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличений, получаемых с помощью М (оптич. прибор) Увеличения от 500 А до 1000 А называют полезными, т. к. при них глаз наблюдателя различает все элементы структуры объекта, разрешаемые М (оптич. прибор) При этом исчерпываются возможности М (оптич. прибор) по разрешающей способности. При увеличениях свыше 1000 А не выявляются никакие новые подробности структуры препарата; все же иногда такие увеличения используют — в микрофотографии, при проектировании изображений на экран и в некоторых других случаях. Существенно более высокими, чем у М (оптич. прибор), разрешающей способностью и, следовательно, полезным увеличением обладает электронный микроскоп.

Методы освещения и наблюдения (микроскопия). Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в М (оптич. прибор) выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Таковы, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора 6 (рис. 1), проходя через объектив 8, дает вблизи фокальной плоскости окуляра 9 равномерно освещенное поле. Если в препарате 7 имеется абсорбирующий элемент, то он отчасти поглощает и отчасти рассеивает падающий на него свет (штриховая линия), что и обусловливает появление изображения. Метод может быть полезен и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить "рельефность" объекта за счет образования теней.

Метод светлого поля в отраженном свете (рис. 3) применяется для наблюдения непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата 4 (от осветителя 1 и полупрозрачного зеркала 2) производится сверху, через объектив 3, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности ее элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля в проходящем свете (рис. 4) применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля. Часто таковы биологические объекты. Свет от осветителя 1 и зеркала 2 направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором темного поля 3. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив 5 (который находится внутри этого конуса). Изображение в М (оптич. прибор) создается лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле 4 препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения 6 на темном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Метод ультрамикроскопии, основанный на том же принципе (препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения), дает возможность обнаружить (но не "наблюдать" в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных М (оптич. прибор) С помощью иммерсионных ультрамикроскопов удается зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 2×10^-9 м. Однако определить форму и точные размеры таких частиц с помощью этого метода невозможно: их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц а от апертуры объектива и увеличения М (оптич. прибор) Т. к. подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются главным образом в коллоидной химии.

При наблюдении по методу темного поля в отраженном свете непрозрачные препараты (например, шлифы металлов) освещают сверху — через специальную кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и называемую эпиконденсором.

Метод наблюдения в поляризованном свете (поляризационная микроскопия) служит для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). К ним относятся многие минералы, зерна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях (см. Оптическая анизотропия) и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отраженном свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него), и эти изменения изучаются с помощью анализатора (см. Поляризационные приборы) и различных компенсаторов оптических. По таким изменениям можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод фазового контраста (и его разновидность — т. н. метод "аноптрального" контраста) служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости ("амплитудный рельеф"), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным. В типичной для этого метода схеме (рис. 5) в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие которой имеет форму кольца. Ее изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклоненные в препарате 4 лучи от осветителя 1, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на l/4 (l — длина волны света). В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнительного сдвига фазы. С учетом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклоненными лучами оказывается близкой к 0 или l/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения 4" препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклоненными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклоненными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в М (оптич. прибор), раздваивается; один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй — мимо нее по той же или дополнительной оптической ветви М (оптич. прибор) В окулярной части М (оптич. прибор) оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей d, которая выражается формулой d = l = (n₀ — n_m)d, где n₀, n_m — показатели преломления частицы и окружающей среды, d — толщина частицы, — т. н. порядок интерференции, l — длина волны света. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференционного контраста показана на рис. 6. Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рис. диагональными стрелками), первая из которых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференционного контраста в некоторых отношениях сходен с методом фазового контраста — оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших ее. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток (и часто применяются именно с этой целью). Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности, используя компенсаторы, с высокой точностью (до ¹/₃₀₀ l) измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Это открывает широкие возможности количественных исследований — на основании таких измерений могут быть рассчитаны общая масса и концентрация сухого вещества в микрообъекте (например, в растительной или животной клетке), показатель преломления и размеры объекта (рис. 7). Метод интерференционного контраста часто сочетают с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете; применение его совместно с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, например, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии обычно относят также методы использования микроинтерферометров.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под М (оптич. прибор) зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами (см. Люминесценция). При этом методе в оптическую схему М (оптич. прибор) вводятся два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введенных в препарат и поглощенных его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют "люминесцентной микроскопией в отраженном свете" (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Метод широко применяется в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на темном нелюминесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность М (оптич. прибор), т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см. выше) от длины волны l применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей l = 400—250 нм, тогда как для видимого света l = 700—400 нм). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счет того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определенных длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматические аминокислоты, некоторые липиды, тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа.

Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространен следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трех длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определенного цвета (например, синим, зеленым и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создается цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путем его фотографирования или с помощью электроннооптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например темных стекол, некоторых и минералов и пр.

Микрофотографирование и микрокиносъемка, т. е. получение с помощью М (оптич. прибор) изображений на светочувствительных слоях, широко применяется в сочетании со всеми другими методами микроскопического исследования. Оптическая система М (оптич. прибор) при микрофото- и микрокиносъемке требует некоторой перестройки — иной по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения, даваемого объективом (подробнее об этом см. в ст. Микропроекция). Многие современные М (оптич. прибор) имеют постоянные (вмонтированные) устройства для микрофотографии, которые позволяют осуществлять такую перестройку и проектировать изображения препаратов на фотопластинку или пленку (а большинство М (оптич. прибор) может быть с этой целью оснащено дополнительными принадлежностями). Микрофотография незаменима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микрокиносъемка важна при исследовании процессов, развертывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста протекания простейших реакций и т. п.).

Основные узлы микроскопа. В большинстве типов М (оптич. прибор) (за исключением инвертированных, см. ниже) над предметным столиком, на котором закрепляют препарат, располагается устройство для крепления объективов, а под столиком устанавливается конденсор. Любой М (оптич. прибор) имеет тубус (трубку), в котором устанавливаются окуляры; обязательной принадлежностью М (оптич. прибор) являются также механизмы для грубой и точной фокусировки (осуществляемой путем изменения относительного положения препарата, объектива и окуляра). Все эти узлы крепятся на штативе или корпусе М (оптич. прибор)

Тип применяемого конденсора зависит от выбора метода наблюдения. Светлопольные конденсоры и конденсоры для наблюдения по методу фазового или интерференционного контраста представляют собой сильно отличающиеся одна от другой двух- или трехлинзовые системы. У светлопольных конденсоров числовая апертура может достигать 1,4; в их состав входит апертурная ирисовая диафрагма, которая иногда может смещаться в сторону для получения косого освещения препарата. Фазово-контрастные конденсоры снабжены кольцевыми диафрагмами. Сложными системами из линз и зеркал являются темнопольные конденсоры. Отдельную группу составляют эпиконденсоры — необходимые при наблюдении по методу темного поля в отраженном свете системы кольцеобразных линз и зеркал, устанавливаемых вокруг объектива. В УФ микроскопии применяются специальные зеркально-линзовые и линзовые конденсоры, прозрачные для ультрафиолетовых лучей.

Объективы в большинстве современных М (оптич. прибор) сменные и выбираются в зависимости от конкретных условий наблюдения. Часто несколько объективов закрепляются в одной вращающейся (т. н. револьверной) головке; смена объектива в этом случае осуществляется простым поворотом головки. По степени исправления хроматической аберрации различают микрообъективы ахроматы и апохроматы. Первые наиболее просты по устройству; аберрация в них исправлена только для двух длин волн, и изображение при освещении объекта белым светом остается слегка окрашенным. В апохроматах эта аберрация исправлена для трех длин волн, и они дают бесцветные изображения. Плоскость изображения у ахроматов и апохроматов несколько искривлена (см. Кривизна поля). Аккомодация глаза и возможность просмотра всего поля зрения с помощью перефокусировки М (оптич. прибор) отчасти компенсируют этот недостаток при визуальном наблюдении, однако он сильно сказывается при микрофотографировании — крайние участки изображения получаются нерезкими. Поэтому широко используют микрообъективы с дополнительным исправлением кривизны поля — планахроматы и планапохроматы. В сочетании с обычными объективами применяют специальные проекционные системы — гомали, вставляемые вместо окуляров и исправляющие кривизну поверхности изображения (для визуального наблюдения они непригодны).

Кроме того, микрообъективы различаются: а) по спектральным характеристикам — на объективы для видимой области спектра и для УФ и ИК микроскопии (линзовые или зеркально-линзовые); б) по длине тубуса, на которую они рассчитаны (в зависимости от конструкции М (оптич. прибор)), — на объективы для тубуса 160 мм, для тубуса 190 мм и для т. н. "длины тубуса бесконечность" (последние создают изображение "на бесконечности" и применяются совместно с дополнительной — т. н. тубусной — линзой, переводящей изображение в фокальную плоскость окуляра); в) по среде между объективом и препаратом — на сухие и иммерсионные; г) по методу наблюдения — на обычные, фазово-контрастные, интерференционные и др.; д) по типу препаратов — для препаратов с покровным стеклом и без него. Отдельный тип представляют собой эпиобъективы (сочетание обычного объектива с эпиконденсором). Многообразие объективов обусловлено разнообразием методов микроскопических наблюдений и конструкций М (оптич. прибор), а также различиями в требованиях к исправлению аберраций в разных условиях работы. Поэтому каждый объектив можно применять только в тех условиях, для которых он рассчитан. Например, объективом, рассчитанным для тубуса 160 мм, нельзя пользоваться в М (оптич. прибор) с длиной тубуса 190 мм; с объективом для препаратов с покровным стеклом нельзя наблюдать препараты без покровного стекла. Особенно важно соблюдать расчетные условия при работе с сухими объективами больших апертур (А > 0,6), которые очень чувствительны ко всяким отклонениям от нормы. Толщина покровных стекол при работе с этими объективами должна быть равна 0,17 мм. Иммерсионный объектив можно использовать только с той иммерсией, для которой он рассчитан.

Тип применяемого окуляра при данном методе наблюдения определяется выбором объектива М (оптич. прибор) С ахроматами малых и средних увеличении используют окуляры Гюйгенса, с апохроматами и ахроматами больших увеличений — т. н. компенсационные окуляры, рассчитываемые так, чтобы их остаточная аберрация была другого знака, чем у объективов, что улучшает качество изображения. Кроме того, существуют специальные фотоокуляры и проекционные окуляры, которые проектируют изображение на экран или фотопластинку (сюда же можно отнести упомянутые выше гомали). Отдельную группу составляют кварцевые окуляры, прозрачные для УФ лучей.

Разнообразные принадлежности к М (оптич. прибор) позволяют улучшить условия наблюдения и расширить возможности исследований. Осветители различных типов предназначены для создания наилучших условий освещения; окулярные микрометры служат для измерения размеров объектов; бинокулярные тубусы дают возможность наблюдать препарат одновременно двумя глазами; микрофотонасадки и микрофотоустановки применяются при микрофотографии; рисовальные аппараты дают возможность зарисовывать изображения. Для количественных исследований применяются специальные устройства (например, микроспектрофотометрические насадки).

Типы микроскопов. Конструкция М (оптич. прибор), его оснащение и характеристики основных узлов определяются либо областью применения, кругом проблем и характером объектов, для исследования которых он предназначен, либо методом (методами) наблюдения, на которые он рассчитан, либо же и тем и другим вместе. Все это привело к созданию различных типов специализированных М (оптич. прибор), позволяющих с высокой точностью изучать строго определенные классы объектов (или даже только некоторые определенные их свойства). С другой стороны, существуют т. н. универсальные М (оптич. прибор), с помощью которых можно различными методами наблюдать различные объекты.

Биологические М (оптич. прибор) относятся к числу наиболее распространенных. Они применяются для ботанических, гистологических, цитологических, микробиологических, медицинских исследований, а также в областях, не связанных непосредственное биологией, — для наблюдения прозрачных объектов в химии, физике и т. д. Существует много моделей биологических М (оптич. прибор), отличающихся конструктивным оформлением и дополнительными принадлежностями, которые существенно расширяют круг изучаемых объектов. К этим принадлежностям относятся: сменные осветители проходящего и отраженного света; сменные конденсоры для работы по методам светлого и темного полей; фазово-контрастные устройства; окулярные микрометры; микрофотонасадки; наборы светофильтров и поляризационных устройств, позволяющие в обычном (неспециализированном) М (оптич. прибор) применять технику люминесцентной и поляризационной микроскопии. Во вспомогательном оборудовании для биологическиого М (оптич. прибор) особенно важную роль играют средства микроскопической техники, предназначенные для подготовки препаратов и проведения с ними различных операций, в том числе и непосредственно в процессе наблюдения (см. Микроманипулятор, Микротом).

Биологические исследовательские М (оптич. прибор) оснащаются набором сменных объективов для различных условий и методов наблюдения и типов препаратов, в том числе эпиобъективами для отраженного света и зачастую фазово-контрастными объективами. Набору объективов соответствует комплект окуляров для визуального наблюдения и микрофотографирования. Обычно такие М (оптич. прибор) имеют бинокулярные тубусы для наблюдения двумя глазами.

Кроме М (оптич. прибор) общего назначения, в биологии широко используются и различные М (оптич. прибор), специализированные по методу наблюдения (см. ниже).

Инвертированные М (оптич. прибор) отличаются тем, что объектив в них располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор — сверху. Направление хода лучей, прошедших сверху вниз через объектив, изменяется системой зеркал, и в глаз наблюдателя они попадают, как обычно, снизу вверх (рис. 8). М (оптич. прибор) этого типа предназначены для исследования громоздких объектов, которые трудно или невозможно расположить на предметных столиках обычных М (оптич. прибор) В биологии с помощью таких М (оптич. прибор) изучают находящиеся в питательной среде культуры тканей, которые помещают в термостатирующую камеру для поддержания заданной температуры. Инвертированные М (оптич. прибор) применяют также для исследования реакций, определения точек плавления материалов и в других случаях, когда для осуществления наблюдаемых процессов требуется громоздкое вспомогательное оборудование. Для микрофотографирования и микрокиносъемки инвертированные М (оптич. прибор) снабжают специальными устройствами и камерами.

Особенно удобна схема инвертированного М (оптич. прибор) для наблюдения в отраженном свете структур различных поверхностей. Поэтому она применяется в большинстве металлографических М (оптич. прибор) В них образец (шлиф металла, сплава или минерала) устанавливается на столике полированной поверхностью вниз, а остальная его часть может иметь произвольную форму и не требует какой-либо обработки. Существуют также металлографические М (оптич. прибор), в которых объект располагают снизу, закрепляя его на специальной пластине; взаимное положение узлов в таких М (оптич. прибор) то же, что и в обычных (неинвертированных) М (оптич. прибор) Изучаемая поверхность часто предварительно протравливается, благодаря чему зерна ее структуры становятся резко отличимыми друг от друга. В М (оптич. прибор) этого типа можно использовать метод светлого поля при прямом и косом освещении, метод темного поля и наблюдение в поляризованном свете. При работе в светлом поле объектив одновременно служит и конденсором. Для темнопольного освещения применяются зеркальные параболические эпиконденсоры. Введение специального вспомогательного устройства позволяет осуществить фазовый контраст в металлографических М (оптич. прибор) с обычным объективом (рис. 9).

Люминесцентные М (оптич. прибор) оснащаются набором сменных светофильтров, подбирая которые можно выделить в излучении осветителя часть спектра, возбуждающую люминесценцию конкретного исследуемого объекта. Подбирается также светофильтр, пропускающий от объекта только свет люминесценции. Свечение многих объектов возбуждается УФ лучами или коротковолновой частью видимого спектра; поэтому источниками света в люминесцентных М (оптич. прибор) служат дающие именно такое (и очень яркое) излучение лампы сверхвысокого давления (см. Газоразрядные источники света). Помимо специальных моделей люминесцентных М (оптич. прибор), имеются люминесцентные устройства, используемые совместно с обычными М (оптич. прибор); они содержат осветитель с лампой, набор светофильтров и т. н. опак-иллюминатор для освещения препаратов сверху.

Ультрафиолетовые и инфракрасные М (оптич. прибор) служат для исследований в невидимых для глаза областях спектра. Их принципиальные оптические схемы аналогичны схеме обычных М (оптич. прибор) Из-за большой сложности исправления аберраций в УФ и ИК областях конденсор и объектив в таких М (оптич. прибор) часто представляют собой зеркально-линзовые системы, в которых существенно уменьшается или полностью отсутствует аберрация. Линзы изготовляются из материалов, прозрачных для УФ (кварц, флюорит) или ИК ( флюорит, излучения. Ультрафиолетовые и инфракрасные М (оптич. прибор) снабжены фотокамерами, в которых фиксируется невидимое изображение; визуальное наблюдение через окуляр в обычном (видимом) свете служит, когда это возможно, лишь для предварительной фокусировки и ориентировки объекта в поле зрения М (оптич. прибор) Как правило, в этих М (оптич. прибор) имеются электроннооптические преобразователи, превращающие невидимое изображение в видимое.

Поляризационные М (оптич. прибор) предназначены для изучения (с помощью оптических компенсаторов) изменений в поляризации света, прошедшего через объект или отраженного от него, что открывает возможности количественного или полуколичественного определения различных характеристик оптически активных объектов. Узлы таких М (оптич. прибор) обычно выполняются так, чтобы облегчить точные измерения: окуляры снабжаются перекрестием, микрометрической шкалой или сеткой; вращающийся предметный столик — угломерным лимбом для измерения угла поворота; часто на предметном столике крепится Федорова столик, дающий возможность произвольно поворачивать и наклонять препарат для нахождения и осей. Объективы поляризационных М (оптич. прибор) специально подбираются так, чтобы в их линзах отсутствовали внутренние напряжения, приводящие к деполяризации света. В М (оптич. прибор) этого типа обычно имеется включаемая и выключаемая вспомогательная линза (т. н. линза Бертрана), используемая при наблюдениях в проходящем свете; она позволяет рассматривать интерференционные фигуры (см. Кристаллооптика), образуемые светом в задней фокальной плоскости объектива после прохождения через исследуемый
С помощью интерференционных М (оптич. прибор) наблюдают прозрачные объекты по методу интерференционного контраста; многие из них конструктивно аналогичны обычным М (оптич. прибор), отличаясь лишь наличием специального конденсора, объектива и измерительного узла. Если наблюдение производится в поляризованном свете, то такие М (оптич. прибор) снабжаются поляризатором и анализатором. По области применения (главным образом биологические исследования) эти М (оптич. прибор) можно отнести к специализированным биологическим М (оптич. прибор) К интерференционным М (оптич. прибор) часто относят также микроинтерферометры — М (оптич. прибор) особого типа, применяемые для изучения микрорельефа поверхностей обработанных металлических деталей.

Стереомикроскопы. Бинокулярные тубусы, используемые в обычных М (оптич. прибор), при всем удобстве наблюдения двумя глазами не дают стереоскопического эффекта: в оба глаза попадают в этом случае под одинаковыми углами одни и те же лучи, лишь разделяемые на два пучка призменной системой. Стереомикроскопы, обеспечивающие подлинно объемное восприятие микрообъекта, представляют собой фактически два М (оптич. прибор), выполненных в виде единой конструкции так, что правый и левый глаза наблюдают объект под разными углами (рис. 10). Наиболее широкое применение такие М (оптич. прибор) находят там, где требуется производить какие-либо операции с объектом в ходе наблюдения (биологического исследования, хирургической операции на сосудах, мозге, в глазу — микрургия, сборка миниатюрных устройств, например транзисторов), — стереоскопическое восприятие облегчает эти операции. Удобству ориентировки в поле зрения М (оптич. прибор) служит и включение в его оптическую схему призм, играющих роль оборачивающих систем; изображение в таких М (оптич. прибор) прямое, а не перевернутое. Так как угол между оптическими осями объективов в стереомикроскопах обычно £ 12°, их числовая апертура, как правило, не превышает 0,12. Поэтому и полезное увеличение таких М (оптич. прибор) бывает не более 120.

М (оптич. прибор) сравнения состоят из двух конструктивно объединенных обычных М (оптич. прибор) с единой окулярной системой. Наблюдатель видит в двух половинах поля зрения такого М (оптич. прибор) изображения сразу двух объектов, что позволяет непосредственно сравнить их по цвету, структуре и распределению элементов и другим характеристикам. М (оптич. прибор) сравнения широко применяются при оценке качества обработки поверхностей, определении сортности (сравнение с эталонным образцом) и т. д. Специальные М (оптич. прибор) такого типа используют в криминологии, в частности для идентификации оружия, из которого выпущена исследуемая пуля.

В телевизионных М (оптич. прибор), работающих по схеме микропроекции, изображение препарата преобразуется в последовательность электрических сигналов, которые затем воспроизводят это изображение в увеличенном масштабе на экране электроннолучевой трубки (кинескопа). В таких М (оптич. прибор) можно чисто электронным путем, изменяя параметры электрической цепи, по которой проходят сигналы, менять контраст изображения и регулировать его яркость. Электрическре усиление сигналов позволяет проектировать изображения на большой экран, в то время как обычная микропроекция требует для этого чрезвычайно сильного освещения, часто вредного для микроскопических объектов. Большое достоинство телевизионных М (оптич. прибор) заключается в том, что с их помощью можно дистанционно изучать объекты, близость к которым опасна для наблюдателя (например, радиоактивные).

При многих исследованиях необходимо вести счет микроскопических частиц (например, бактерий в колониях, аэрозолей, частиц в коллоидных растворах, клеток крови и т. д.), определять площади, занимаемые зернами одного и того же рода в шлифах сплава, и производить др. аналогичные измерения. Преобразование изображения в телевизионных М (оптич. прибор) в серию электрических сигналов (импульсов) дало возможность построить автоматические счетчики микрочастиц, регистрирующие их по числу импульсов.

Назначение измерительных М (оптич. прибор) состоит в точном измерении линейных и угловых размеров объектов (зачастую совсем не малых). По способу измерения их можно разделить на два типа. Измерительные М (оптич. прибор) 1-го типа применяются только в тех случаях, когда измеряемое расстояние не превышает линейных размеров поля зрения М (оптич. прибор) В таких М (оптич. прибор) непосредственно (с помощью шкалы или винтового окулярного микрометра) измеряется не сам объект, а его изображение в фокальной плоскости окуляра, и лишь затем, по известному значению увеличения объектива, вычисляется измеренное расстояние на объекте. Часто в этих М (оптич. прибор) изображения объектов сравниваются с образцовыми профилями, нанесенными на пластинки сменных окулярных головок. В измерительныхМ (оптич. прибор) 2-го типа предметный столик с объектом и корпус М (оптич. прибор) можно с помощью точных механизмов перемещать друг относительно друга (чаще — столик относительно корпуса); измеряя это перемещение микрометрическим винтом или шкалой, жестко скрепленной с предметным столиком, определяют расстояние между наблюдаемыми элементами объекта. Существуют измерительные М (оптич. прибор), у которых измерение производится лишь в одном направлении (однокоординатные М (оптич. прибор)). Гораздо более распространены М (оптич. прибор) с перемещениями предметного столика в двух перпендикулярных направлениях (пределы перемещений до 200´500 мм); для специальных целей применяются М (оптич. прибор), в которых измерения (а следовательно, и относительные перемещения столика и корпуса М (оптич. прибор)) возможны в трех направлениях, соответствующих трем осям прямоугольных координат. На некоторых М (оптич. прибор) можно проводить измерения в полярных координатах; для этого предметный столик делают вращающимся и снабжают шкалой и нониусом для отсчета углов поворота. В наиболее точных измерительных М (оптич. прибор) 2-го типа употребляются стеклянные шкалы, а отсчеты на них осуществляются с помощью вспомогательного (т. н. отсчетного) микроскопа (см. ниже). Точность измерений в М (оптич. прибор) 2-го типа значительно выше по сравнению с М (оптич. прибор) 1-го типа. В лучших моделях точность линейных измерений обычно порядка 0,001 мм, точность измерения углов — порядка 1". Измерительные М (оптич. прибор) 2-го типа широко применяются в промышленности (особенно в машиностроении) для измерения и контроля размеров деталей машин, инструментов и пр.

В устройствах для особо точных измерений (например, геодезических, астрономических и т. д.) отсчеты на линейных шкалах и разделенных кругах угломерных инструментов производят с помощью специальныхотсчетных М (оптич. прибор) — шкаловых М (оптич. прибор) и М (оптич. прибор)-микрометров. В первых имеется вспомогательная стеклянная шкала. Ее изображение регулировкой увеличения объектива М (оптич. прибор) делают равным наблюдаемому интервалу между делениями основной шкалы (или круга), после чего, отсчитывая положение наблюдаемого деления между штрихами вспомогательной шкалы, можно непосредственно определить его с точностью около 0,01 интервала между делениями. Еще выше точность отсчетов (порядка 0,0001 мм) в М (оптич. прибор)-микрометрах, в окулярной части которых помещен нитяной или спиральный микрометр. Увеличение объектива регулируют так, чтобы перемещению нити между изображениями штрихов измеряемой шкалы соответствовало целое число оборотов (или полуоборотов) винта микрометра.

Помимо описанных выше, имеется значительное число еще более узко специализированных типов М (оптич. прибор), например М (оптич. прибор) для подсчета и анализа следов элементарных частиц и осколков деления ядер в ядерных фотографических эмульсиях, высокотемпературные М (оптич. прибор) для изучения объектов, нагретых до температуры порядка 2000 °С, контактные М (оптич. прибор) для исследования поверхностей живых органов животных и человека (объектив в них прижимается вплотную к изучаемой поверхности, а фокусировка М (оптич. прибор) производится специальной встроенной системой).

Часто М (оптич. прибор) в качестве важной составной части используются в сложных установках в сочетании с другими приборами. Примерами могут служить предназначенные для определения спектров поглощения препаратов микроспектрофотометрические установки (см. Спектрофотометр), в которых М (оптич. прибор) объединены со специальными монохроматорами и устройствами, измеряющими световые потоки; ряд приборов, применяемых в офтальмологии; компараторы, микрофотометры и многие др.

Лит.: Михель К., Основы теории микроскопа, пер. с нем., М (оптич. прибор), 1955; Ринне Ф., Берек М (оптич. прибор), Оптические исследования при помощи поляризационного микроскопа, пер. с нем., М (оптич. прибор), 1937; Мы, под ред. Н. И. Полякова, М (оптич. прибор), 1969; Тудоровский А. И., Теория оптических приборов, 2 изд., ч. 1—2, М (оптич. прибор) — Л., 1948—52; Франсон М (оптич. прибор), Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., М (оптич. прибор), 1960; Федин Л. А., Мы, принадлежности к ним и лупы, М (оптич. прибор), 1961; Федин Л. А., Барский И. Я., Микрофотография, Л., 1971; Оптические приборы для измерения линейных и угловых величин в машиностроении, М (оптич. прибор), 1964.

Л. А. Федин.

		Новости 22.12.2024 16:53:01

	Copyright © 1999-2024 Oval.ru, All Rights Reserved.